心臓筋線維の階層構造を模倣した導電性足場

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2863 (2023) この記事を引用

1267 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

心筋の筋線維の独特の方向配列を模倣した導電性足場は、3D プリンティングマイクロステレオリソグラフィー技術を使用して製造されます。ポリエチレングリコールジアクリレート (感光性ポリマー)、イルガキュア 819 (光開始剤)、クルクミン (染料)、およびポリアニリン (導電性ポリマー) をブレンドして、フリーラジカル光重合反応を使用して架橋される導電性インクを作成します。クルクミンは液体フィルターとして機能し、光が感光性溶液の奥深くまで浸透するのを防ぎ、3D プリントプロセスで中心的な役割を果たします。得られた足場は、平均孔径 300 ± 15 μm の明確な形態と、導電率約 10-6 S/m の半導体特性を示します。サイクリックボルタンメトリー分析は電気活性を検出し、電子の移動にポリマーと電解質溶液間のイオン拡散がどのように関与しているかを強調します。足場は、37 °C の PBS に浸漬してから 30 分後に最大膨張範囲に達し、4 週間後にはポリエチレングリコールネットワークに典型的な遅い加水分解速度を示します。導電性足場は調整可能な導電性を示し、培養マウス心臓前駆細胞に最適な環境を提供します。

生体組織は通常、その組織に埋め込まれた細胞の種類、その機構に寄与するさまざまな分子の発現、および分化のさまざまな段階で分泌される因子のファミリーによって分類されます。しかし、細胞間のコミュニケーションと機能に不可欠な微弱な電流も流れています1。心筋と神経では、これらの基礎電流は、隣接する細胞を通って身体の最末梢領域に伝わる信号と機械的力を生み出すことができる自己生成周期的電波によって重畳されます。これに関連して、心筋組織の機能は、心臓組織の独特の機械的特性と異方性構造によって調節されます。この構造では、広い三次元細胞外マトリックス (ECM) ネットワークが心筋細胞の方向を定め、心筋細胞を機械的に結合して電気的接続を確保し、心室収縮中に弾性サポートを提供します。心筋線維の方向は、心室壁全体にわたって経壁的に変化します。これらの線維は心内膜下領域で右螺旋方向に走り、中壁を円周方向に通過し、心外膜下領域で左螺旋方向に向きを変え、心臓のポンピングに大きく貢献します2,3。とりわけ、外傷性の出来事や変性疾患は、心臓の生来の再生能力が低いために、この素晴らしい生体構造に修復不可能な損傷をもたらすことがよくあります4。損傷した領域はコラーゲンが豊富な瘢痕組織に置き換わり、心室の形状を歪め、電気信号の定期的な流れを妨げ、長期的には不整脈や心不全を引き起こします5。

過去数十年間の生物科学、工学、材料科学、および高度なマイクロ/ナノ製造技術の進歩により、健康な心筋のストライプを作製して移植することによって損傷した心室領域を修復できる可能性が示唆されてきました。この目的を達成するために、心筋組織の生体構造と機能の複雑さを適合させるために、学際的なアプローチ (組織工学) が採用されています。典型的な組織工学実験では、組織の ECM を漠然とエミュレートする生体適合性ポリマー足場に幹細胞が播種されます。足場は通常、天然または合成の生体材料、または両方の組み合わせ（足場）で構成されており、このアプローチを使用して、いくつかの人工心臓様組織が操作され、生体内に移植されています6、7、8、9、10、11。しかし、世界中で並外れた努力がなされているにもかかわらず、その結果は臨床使用を想定するにはまだ十分ではありません 12,13。この失敗の原因は、とりわけ、組織の生体構造を適切に模倣していない足場に主に見出されます14。当初、足場は培養細胞が成長し増殖するための機械的な支持体としてのみ意図されていました。その後、細胞が独自の ECM を分泌するのを待っている間に、足場の特定の物理的、化学的、機械的、生物学的特性によって細胞分化を促進できることが明らかになりました。

これらの特性のいくつかまたはすべてを実証する足場に関する広範な文献が見つかります 15、16、17、18。しかし、現在使用されている非導電性足場では、2 つの主要な問題が適切に対処されていません。 1 つ目は、適切な心筋細胞の配向を誘導する能力を足場にどのように付与するかということです。 2つ目は、導電性環境を作り出すことで、ギャップ結合の組織化がまだ不十分なために導電性が低下している未熟な心臓幹細胞間の細胞間コミュニケーションと同期がどのように改善されるかということである。

ギャップ結合は、心臓壁を通した活動電位の効率的な伝播とシグナル伝達分子の拡散に必要なイオンの迅速な交換を可能にする細胞膜構造です。しかし、ヒト心筋細胞のギャップ結合は、新生児期には細胞表面全体に分布しており、ヒトが6歳になって初めて最終的な成熟と挿入板への分極に達します19。同様の分布がマウスとイヌでも観察され、動物の生後90日後にのみギャップ結合が成熟し分極に達しました20。これらのデータは、心筋の電気伝導度が 2 つの異なる電気グリッドに関連していることを示唆しています。1 つ目は幼少期に活動し、ECM に基づいており、発達中の未熟細胞へのシグナル伝達に大きく貢献します。 2 つ目は通常、成熟した心筋細胞に基づいており、収縮の刺激を伝達し、確立されると細胞の表現型にあまり影響を与えません。

生体材料および生体システムを調製するための革新的な方法に関する以前の研究21、22、23から出発して、本研究の主な目的は、技術的観点から3Dプリンティング投影マイクロステレオリソグラフィーアプローチを使用して、心臓筋線維の階層的配向を模倣する導電性足場を開発することでした。

導電性は、導電性ポリマーポリアニリン (PANI) とポリエチレングリコールジアクリレート (PEGDA) ハイドロゲルをブレンドして 3D プリント用の導電性インクを作成することによって実現されました。得られた足場は、平均孔径 300 ± 15 μm の半導体特性 (約 10-6 S/m) を示しました。導電率は、前駆体溶液中の PANI の濃度を制御することで簡単に調整できます。導電性足場上で培養したマウス心臓前駆細胞の生存率は、非導電性足場上で培養した細胞と同等でした。

全ての試薬は、特に明記されている場合を除き、Merck KGaA から購入し、受け取ったまま使用しました。

PANI は、事前に最適化されたプロトコルに従って合成されました 24。簡単に説明すると、減圧下で蒸留した後、5 mmolのアニリン (Fluka) を、適量のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を含む 1 M HCl 溶液に加え、30 分間超音波処理しました。並行して、5 mmolの過硫酸アンモニウムを別の1 M HCl溶液に加えた。この混合物を上記のアニリン混合物にゆっくりと加え、0 ～ 5 °C に冷却し、6 時間撹拌しながら放置しました。この間、暗緑色の PANI 沈殿物が形成され始め、アニリンの PANI への重合を示しました。完全に沈殿させた後、PANIを濾別し、1M HCl溶液、次いで水、エタノールで徹底的に洗浄した。徹底的に洗浄した後、スラリーを真空下、50℃で一晩乾燥させた。次いで、得られたＰＡＮＩ粉末を乳鉢と乳棒で粉砕して、細かい粒径を得た。

光重合の前駆体溶液は、感光性ポリマーとして PEGDA (分子量 575 Da)、光吸収色素としてクルクマロンガから抽出されたクルクミン、およびビス(2,4,6-トリメチルベンゾイル)-フェニルホスフィンオキシド (同様に) のブレンドでした。 Irgacure 819 として知られています）が光開始剤として使用されます。クルクミンとイルガキュアをPEGDA:エタノールの体積比3:1の溶液に溶解して、前駆体システムを得ました(表1)。アルミホイルで覆われたフラスコを、暗所で撹拌するために一晩放置した。その後、適量の合成された PANI 粉末を超音波処理と磁気撹拌によって前駆体溶液に分散させました。このプロセスを毎回繰り返して、分散量の異なる PANI を含む光硬化性インクを得ました。

図 1 に示すように、投影型マイクロステレオリソグラフィー (PμSL) を使用して足場を作製しました。PμSL セットアップ全体は光学ブレッドボード上に取り付けられました。足場を製造するには、まず、形状、孔径、ジオメトリ、寸法などの最適な設計パラメータを考慮した後、Windows 用 AutoCAD ソフトウェアバージョン 2016 (https://www.autodesk.com/products/autocad) を使用して設計しました。ステレオリソグラフィーファイル (.stl) がエクスポートされ、Windows 用 Slic3r ソフトウェアバージョン 1.3.0 (https://slic3r.org/) を使用して 3D ジオメトリを 2D 投影に仮想的にスライスするために使用されました。これらのスライスされた投影はデジタル印象として使用され、PowerPoint ソフトウェアで作成することもできます。光束 3400 ルーメンの高圧水銀アークランプを備えたオーバーヘッドプロジェクター (Acer X1385WH) を可視光の光源として使用しました。

カスタムビルドの 3D プリンティングマイクロ光造形セットアップのスキーム。足場は AutoCAD を使用して設計され、3D ジオメトリはデジタルフォトマスクとして機能する 2D 投影/印象に仮想的にスライスされます。プロジェクターはこれらの印象を鏡に照射し、感光性溶液の表面に反射します。溶液の光が当たった領域のみが光重合反応によって架橋され、固体層が印刷されます。ステージが数ミクロン下に移動し、新しい溶液がこの印刷層を覆います。再度、溶液に別の印象を与えて、最初の層の上に 2 番目の層を堆積させます。このようにして、2D 層を互いの上に堆積することによって 3D 足場が製造されます。一部の画像は、CC-BY 3.0 ライセンスに基づいて Servier Medical Art から取得したものです。

ステージの 3 軸の動きは、ステージに取り付けられたマイクロメータによって手動で制御され、各軸に沿って最小 10 μm の距離でステージを移動できました。印刷プロセスを開始する前に、ステージを各印刷層の厚さに相当する溶液中に 100 μm 浸漬しました。次に、プロジェクターから凸レンズ (焦点距離 = 201.0 mm) を介して各印象が鏡に焦点を合わせます。そして、ステージを浸した感光液の表面に反射させました。印象が照射された感光性溶液の領域は、フリーラジカル重合反応によって溶液を架橋し、これにより 2D 層が生成されました。この印刷層の厚さは、ステージが最初に溶液中に浸漬された深さに対応する１００μｍであった。最初の層の堆積後、ステージを再び溶液に 100 μm 浸し、新しい溶液がこの印刷層を覆いました。次いで、第２の印象を照射して、第１の層の上に厚さ１００μｍの第２の層を堆積させた。互いの上に層を連続的に堆積することで、各層の厚さが制御された 3D 足場が生成されました。ＰＥＧＤＡマトリックスは、溶液が繊維状の印象とは対照的に固体の印象（例えば完全な円）で照明されたときに生成された。これにより、図 1 で説明したのと同じフリーラジカル重合反応により、細孔のない固体層が生成されました。

吸光度スペクトルは、分光光度計 (Perkin Elmer Lambda 750) を使用して 300 ～ 800 nm の範囲で取得しました。走査電子顕微鏡法 (SEM) を実行して、足場の形態を分析しました。 HITACHI TM 4000 走査型電子顕微鏡を使用して、足場の表面をさまざまな電圧 (5、10、15 kV) および倍率でスキャンしました。赤外分光分析は、ダイヤモンド結晶 ATR 統合モジュールを備えた ThermoFisher Scientific™ Nicolet™ iS50 FTIR 分光計を使用して実行されました。スキャンは吸光度モードで4000と500cm-1の間で実行されました。

足場のバルク導電率は、Keithley 2700 Multimeter を使用した室温での 2 つのプローブ導電率測定によって評価されました。足場 (数ミクロンの薄さ) を 2 つのスチール製プローブ (半径 1.5 mm) の間に配置し、時間掃引モードで電気抵抗を測定しました。さまざまな時点でスキャンされた抵抗は、LabVIEW ソフトウェアを使用して記録されました。電気伝導率は式(1)を使用して計算されました。 (1):

ここで、σ = 導電率 (S/m)、l = 足場の厚さ (m)、r = スチールプローブの半径 (m)、R = 平均電気抵抗 (Ω)。

電気化学的応答は、Palm Sense コンパクト電気化学ワークステーションを使用した標準的な 1 コンパートメント 3 電極セルでサイクリックボルタンメトリー (CV) を使用して評価されました。 CV 曲線は、異なるスキャン速度 (10 ～ 18 mV/s) で + 0.4 V ～ + 0.9 V の範囲で得られました。飽和カロメル電極 (SCE) と白金箔をそれぞれ参照電極と対電極として使用しました。作用電極は、調査用足場の裏側にプラチナ接点を提供することによって実現されました。

膨潤度を測定して、生理学的条件（pH = 7.4、37 °C）下での足場の膨潤限界を評価しました。足場を 1X PBS に浸し、37 °C に維持しました。膨潤度は、次の式を使用して、異なる時間間隔で乾燥足場と湿潤足場の間の質量差を測定することによって決定されました。 (2):

ここで、Mw = 時間 t における湿った足場の質量、Md = 乾燥した足場の質量。

分解速度を監視して、さまざまな足場の分解速度を調べました。この目的のために、足場を 1X PBS に 37 °C で 4 週間浸漬しました。各週後、完全に膨潤した足場の質量と各週後の足場の質量との差を測定することによって、各足場がどれだけの質量を失ったかを、次の式を使用して計算した。 (3):

ここで、Ms = 完全に膨らんだ足場の質量、Mt = 時間 t における足場の質量。

マウス心臓前駆細胞 (mCPC) を使用して、足場の生体適合性をテストしました。細胞は、以前に記載されているように、6 週齢の C57/BI マウスの心臓から単離されました 25。細胞は、10% FBS (Gibco)、1% ペニシリン - ストレプトマイシン、および 1% L-グルタミン (Sigma Aldrich) を含む DMEM (Gibco) で培養しました。細胞播種の前に、滅菌のために足場を 70% エタノール溶液に 1 時間浸漬しました。この後、それらを無菌の換気された生物学的フード内で乾燥させ、24ウェルプレートに配置した。次に、足場を滅菌 PBS で洗浄し、20% FBS を含む DMEM で 37 °C で 24 時間平衡化し、細胞接着を改善しました。

細胞を 2 × 104 細胞/cm2 の密度で播種し、10% FBS を含む DMEM 中で 37 °C でインキュベートしました。足場のないウェルに置かれた細胞を対照群とみなした。 120 時間後、各ウェルの付着細胞と浮遊細胞の両方を収集し、0.4% トリパンブルーアッセイで染色して生存率を評価しました (Sigma-Aldrich、ミラノ、イタリア)。生細胞と死細胞は、倒立光学顕微鏡下で３回繰り返して計数された。

統計分析は、GraphPad Prism (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ、https://www.graphpad.com) を使用して実行されました。 6 つの独立した実験からのデータが定量化され、各変数について分析されました。等分散の両側 t 検定を使用して平均値と一元配置分散分析検定を比較しました。統計的有意性の閾値は P < 0.05 に設定され、サンプルの種類ごとに平均値の標準偏差 (SD) が計算されました。データは平均値 ± SD として表示されます。

光重合反応の効率は、前駆体溶液中の個々の成分の光吸収能力のバランスに大きく依存します。この能力は、溶液中を通過する際に溶液の 1 センチメートルあたりにどれだけの光が吸収されるかを示す吸収係数 (α) の観点から説明できます。それを計算するために、まず、図2a〜cに示すように、分光光度計を使用して、より低濃度での成分の吸光度対波長スペクトルが得られました。 UV-可視分光法は濃縮溶液ではうまく機能しないため、溶液中の実際の濃度に対するこれらのスペクトルの直接測定は得られませんでした。

(a) エタノール中のクルクミン、(b) アセトン中の Irgacure、および (c) 低濃度の PEGDA 中の PANI の吸光度スペクトル。挿入図は、折れ線グラフを得るために各成分のこれらの濃度に対してプロットされた 400 nm での吸光度の値を示しています。これらの外挿された折れ線グラフは、実際の合成で使用される吸光度の値を推定するために使用されました。 (d) 最終溶液中の実際の濃度に対するすべての成分の 300 ～ 800 nm の波長範囲における吸収係数。

低濃度で複数の吸光度対波長スペクトルを得た後、400 nm カットオフでの吸光度値を対応する濃度に対してプロットして、すべての成分の吸光度対濃度の折れ線グラフを取得しました。この折れ線グラフは、吸収率が同じままであるため、どの波長でも取得できます。

折れ線グラフを外挿して、溶液中の実際の濃度に対する吸光度値を推定し、これらの値を式 1 に代入しました。 (4) 400 nm の波長におけるすべての成分の吸収係数を計算するには、次のようにします。

ここで、A = 折れ線グラフの吸光度値、d = 光路長 = 0.1 cm (キュベットの厚さ)。

吸収係数は300〜800 nmの波長範囲内で計算され、図2dにプロットされ、前駆体溶液中のクルクミン、イルガキュア、およびPANIの相対吸収力が示されています。光を吸収する個々の成分間のこの競争意識により、最終溶液中の最適な濃度を見つけることができました。たとえば、(i) イルガキュアの濃度は、フリーラジカルを生成して溶液を架橋するのに十分な濃度である必要があります。(ii) クルクミンは、光が溶液の奥深くまで浸透するのを避けるのに十分な濃度である必要がありますが、同時に可能な限り濃度を低くする必要があります。光エネルギーを多く吸収せずにフリーラジカルの生成を可能にするためには、(iii) PANI は入射光のほとんどを吸収すべきではありませんが、高度に不活性な PEGDA マトリックスに導電性を付与するには十分でなければなりません。当社の特注投影マイクロ光造形装置では、光重合反応は「光重合反応の可視領域」と呼ばれる 400 ～ 450 nm の範囲内で発生しました。この範囲を超えると、図 2 (右下) に示すように、イルガキュアは光を吸収して架橋のためのフリーラジカルを生成しません。一般に、クルクミンは、同じ濃度のイルガキュアと比較して光を強く吸収します。したがって、最終溶液では、その濃度は Irgacure の濃度 (1.83%) と比較してはるかに低く保たれました (0.016%)。

筋線維の向きは、心筋の厚さに応じてさまざまな角度に沿って変化します（図3a）。筋線維は、心外膜下領域では + 70° から + 50°、中壁では 0°、心内膜下領域では - 50° から - 70° まで回転します26。この多用途のバイオアーキテクチャを模倣するために、図 3b に示すように、各印刷層のストランドをこれらの角度に沿って整列させました。これらの 2D レイヤーを互いの上に堆積させることで、3D 足場が作成されました。図 3c ～ f は、3D プリントされた足場の光学画像を示しています。この研究では、2 本のストランド間の距離は、国際接頭辞システムと一致する細孔サイズ分類に従って「細孔サイズ」として記載されています 27。 ImageJ ソフトウェアを使用して測定した非導電性 PEGDA 足場の平均ストランド直径は 345 ± 6 μm、細孔サイズは約 292 ± 13 μm でした。一方、導電性足場の平均ストランド直径は 370 ± 10 μm、平均孔径は 300 ± 15 μm でした。足場内部のPANI相の均一な分布により、特徴的な濃い色が得られ（図3g）、高度に不活性なPEGDAマトリックスに半導体特性が与えられました。電流は、電子ホッピング機構を介してPANIチェーンを流れることができます。つまり、電気的に刺激されると、自由電子が1つのポーラロン/バイポーラロン(ドープされたPANIに固有)から別のポーラロン/バイポーラロンにジャンプすることができます。導電性メカニズムの詳細については、別の場所で説明します28。

印刷された足場の構造と形態。 (a) 心筋では、筋線維は階層的に異なる角度で配向されています。 (b) これらの角度に沿って整列した異なる層を互いに積み重ねて、この構造を模倣した 3D 足場を得ました。 (c) 5X および (d) 10X での非導電性 PEGDA 足場、(e) 5X での導電性足場 (0.3% PANI)、および (f) 10X。 (g) 異なる濃度の PANI を含む足場。図 3A は、CC-BY 3.0 ライセンスに基づいて Servier Medical Art を使用して作成されました。

この 3D プリンティングプロセスでは、クルクミンが液体フィルターとして使用されました。これにより、光が溶液の奥深くまで浸透して下部の印刷層に到達するのを防ぎ、光重合反応が起こるのに十分な光エネルギーを溶液の上部のみが受け取るようにしました。クルクミンが存在しない場合、光は溶液の奥深くまで浸透し、図4に示すように、閉じた細孔と貧弱な形態を持つ足場が生成されました。

カスタム構築された 3D 印刷セットアップにおけるクルクミンの役割。足場は、前駆体溶液中のクルクミンを含む明確な形態と開いた細孔を示しました (左、5X)。クルクミンが存在しない場合、層は相互に拡散し、足場の形態が悪く、細孔が閉じてしまいました (右、5X)。クルクミンが含まれているため、足場間で特徴的な黄色が見分けられます (左上)。

走査型電子顕微鏡検査を行って、印刷された足場の形態を評価した。図5a〜cに見られるように、前駆体溶液にPANIが存在しない場合、得られた非導電性足場は、溶液の光透過性により、明確に定義された形状と細孔サイズを持っていました。逆に、PANI を含む溶液では、図 2 (右下) に示すように、PANI も入射光を吸収し始めるため、印刷がより複雑になります。これにより、PANI濃度に応じて光重合反応がある程度非効率になり、図5d〜fに示すように、得られた足場は不規則な細孔サイズを備えたやや粗い形状になりました。これに取り組むために、表 1 に示すように、1 回の印象ごとにソリューションを長時間露光しました。PANI 濃度が 2.0% を超えると、明確に定義された幾何学的特徴を持つ足場を印刷するのは非常に困難でした。これは、これらの濃度での PANI の吸収係数 (α) が、溶液架橋を困難にする他の成分の光吸収能力を上回るほど十分に高かったという事実と関連付けることができます。このため、この濃度では溶液を架橋するフリーラジカルは生成されませんでした。さらに、PANI 濃度が 2.5% および 3.0% では、溶液の粘度が高くなりすぎて使用できなくなりました。 1 回の印象につき 20 秒を超える露出の後でも、適切な形態と孔サイズを備えた明確に定義された足場は決して得られませんでした。これらの濃度では固体ディスクのみが得られ、図5g〜hに示すように電子顕微鏡検査およびその他の技術を使用してさらに特徴付けされました。

印刷された足場の形態。 (a) PANI を含まない PEGDA のマトリックス、(b) 60 倍および (c) 150 倍の非導電性 PEGDA 足場、(d) PEGDA マトリックスに埋め込まれた 2% PANI、(e) 50 倍の 2% PANI を含む導電性足場、および(f) 100 倍、(g) しわの多い形態は 100 倍、(h) 200 倍の倍率で PEGDA マトリックス中の 3% PANI の均一な分布を示します。

足場の階層的形態も、より詳細な SEM 分析を使用して評価されました。図6a〜cはPANIを含まないPEGDA足場に対応しますが、図6d〜fではPEGDA-PANI足場に2.0％のPANIが含まれています。図6aの円で示される異なる角度でストランドが回転していることがわかります。より拡大した画像（図6b）は、図3bの層番号に対応する番号で示された足場の深部にあるさまざまなストランドの回転を示しています。足場の断面図は図6c、fに見られ、ストランドが紙面内に移動します。これらの図では、ストランドが異なる角度で整列しながら互いの上に堆積されていることがわかり、足場の階層的形態を確認することができる。当社特注の PμSL プリンタを使用して印刷可能な PANI の最大濃度は 2.0% でした。これが、これらの粒子が図5dのPEGDAマトリックスに埋め込まれているのと同じように、図6fに多くのPANI粒子が見られる理由です。これとは対照的に、PANIを含まない足場は、図6c、5b、および5cに示すように、明確に定義された形態を有していた。

印刷された足場の階層的形態。 (a) 44X の PEGDA 足場、円は足場の奥深くまでストランドが回転することを示します。(b) 133X の PEGDA 足場、数字は上部の層 1 と、特定の角度で回転する足場の奥深くに続く後続の層を示します。(c) 十字-107Xでの断面図、(d)2.0% PANIを含むPEGDA足場、44Xでの断面図、および(e)133Xでの断面図、(f)67Xでの断面図は、3D印刷中に互いの上に堆積されたさまざまな層を表しています。

PANI は、完全に還元されたロイコエメラルジン、部分的に酸化されたエメラルジン、および完全に酸化されたペルニグラニリンの 3 つの酸化還元状態で存在します 29。これらの構造は、酸性環境でも塩基性環境でも、それぞれプロトン化または脱プロトン化される可能性があります。プロトン化のないこれらの形態は、エメラルジン塩基などの「塩基」と呼ばれます。プロトン付加後は、エメラルディン塩などの「塩」と呼ばれます。エメラルディン塩は、PANI の唯一の導電性形態です。赤外分光法により、PANI 鎖の酸化状態に関する情報が得られました。振動スペクトルの分析により、合成プロセス中に達成されたPANIのプロトン化されたエメラルディン形態が指摘されました（図7）。

PANI (青)、PEGDA に埋め込まれた PANI (赤)、および PEGDA (黒) の導電性 (エメラルディン塩) 型の FTIR-ATR スペクトル。

特に、PANI および PEGDA-PANI 複合材料のスペクトル (それぞれ青線と赤線) では、ベンゼン環と C の C-H 曲げ振動モードを表す 809 cm-1 と 1569 cm-1 のピークが観察できます。 =C キノイド環の伸縮 30,31。 PANI スペクトルでは 1226 cm-1 のピークが PEGDA-PANI では 1190 cm-1 にシフトしていますが、これはベンゼノイドグループの C-N 伸縮モードに起因すると考えられます 32。これらの独特のシグナルは、導電性形態、すなわちエメラルディン塩のPANIの合成が成功したことを裏付ける。特徴的な PEGDA ピークは、PEGDA スペクトルと PEGDA-PANI スペクトルの両方で 1095、1723、および 2868 cm-1 に見られます (それぞれ黒線と赤線)。これらの信号はそれぞれ、PEGDA バックボーンの -C-O-C-、-CH、および -C=O の伸縮振動に起因すると考えられます 33。

2 プローブ技術を使用して、印刷された足場のバルク電気伝導率を測定しました。表２は、マウス心筋組織および不活性ＰＥＧＤＡ足場の値と比較した、ＰＥＧＤＡ－ＰＡＮＩ足場について得られた値を報告する。 PEGDA は、プラスチック絶縁体に典型的な 10 ～ 9 S/m の範囲の導電率を特徴とすることがわかります。しかし、この不活性足場に PANI を導入すると、導電率が 103 倍〜 10-6 S/m まで増加し、半導体的な挙動が得られました。この値は、同じフィラー量を使用した PEGDA-PANI 材料で得られた値に匹敵します 34。 PANI濃度の増加に伴う導電特性の改善は、PEGDAマトリックス内部に均一な導電ネットワークが形成されることによってPANI鎖間のより効率的な電荷移動が達成されたことを示しています。 PANI 含有量が 0.9% 以下では電気的反応は検出されませんでした。これは、ポリマー鎖間にバルク導電ネットワークが欠如していることが原因である可能性があります。

サイクリックボルタンメトリー (CV) 測定を実行して、製造された足場の電気化学的活性をテストしました。分析は 0.1 M HCl 溶液中で実行され、データはさまざまなスキャン速度で取得されました。図 8 から、CV 曲線がそれぞれ + 0.74 V および + 0.66 V 付近に幅広い陽極 (Ea) および陰極 (Ec) のピークを示していることが明らかです。この酸化還元対は、PANI エメラルジンの半酸化型からペルニグラニリンの完全酸化型への遷移、およびその逆の遷移に関連している可能性があります 36,37。このような電気化学的特徴の存在は、酸化還元プロセスの化学的可逆性を示しています。さらに、電気的挙動で判明したことによると、PEGDA マトリックス中の PANI 濃度の増加に伴って電流密度の増加が観察されました。興味深いことに、0.3% および 0.6% PANI を含む足場は CV 実行中に電気刺激に応答することができますが、2 プローブ法では導電率値を測定することはできません。これらの結果は、電気化学プロセスに電子の移動だけでなく、ポリマーと電解質溶液間のイオン拡散も含まれることを考慮すると明確になる可能性があります。

(a) 0.3% PANI、(b) 0.6% PANI、(c) 0.9% PANI、(d) 1.5% PANI の異なるスキャン速度での導電性足場のサイクリックボルタモグラム。

図8で観察できるように、10〜80mV/sの範囲のスキャン速度で電流密度の増加が見られました。陽極ピーク (EA) はその位置を維持しますが、陰極 (EC) ピークはわずかに低い電位にシフトします。この特徴は、おそらくプロセスの複雑な反応速度による連鎖還元の部分的な電気化学的不可逆性と関連している可能性があります。また、電子移動に伴う化学的/構造的変化によるものである可能性もあります22。簡単に言うと、電気化学的研究の分析により、ハイドロゲル PEGDA マトリックスへのイオン濃度を調節する PANI 包接の電気活性と能力が強調されました。このようにして、この特徴をいくつかの生物医学分野で効率的に利用して、生物システムの電気的性質を模倣するデバイス/足場を製造することができます。

膨潤度は、足場を 1X PBS に 37 °C で 24 時間浸漬することによって測定しました。図 9 に示すように、足場の最大膨潤度 (≤ 60%) は、通常急激な膨潤挙動を示す典型的なヒドロゲルと比較して顕著ではありません。突然拡大する環境にさらされた培養細胞は、拡大するハイドロゲルネットワーク内で発生する高いストレスにより、アポトーシスを引き起こす可能性があります 38。私たちの場合、すべての足場はある程度安定した膨潤挙動を示し、PBS に浸漬してから 30 分以内に限界に達しました。 PEGDA マトリックス内に PANI が存在すると、その濃度に関係なく膨潤の程度が減少しました。これは、純粋なPEGDAヒドロゲル足場と比較して複合材料の剛性がおそらく高いためである可能性があります。

異なる濃度の PANI を使用した 3D プリント足場の膨潤度。

通常、PEGDA ハイドロゲルのラジカル架橋中に形成されるエステル結合 (-O-C=O) が、加水分解反応を起こしやすい39。

図 10 でわかるように、低濃度では、実験誤差の範囲内で、分解プロセスと PEGDA マトリックス内の PANI の存在との間に有意な相関関係はありません。 2% PANI を含めるとより一貫した分解が記録され、4 週間後には 15% の質量損失に達します。これは、そのサンプル中に PANI がより多く存在することによって合理的に誘発される、より低い PEGDA 架橋結合に関連している可能性があります。

さまざまな濃度の PANI を使用した 3D プリント足場の加水分解プロファイル。

図 11 に示すように、マウス心臓前駆細胞 (mCPC) の生存率を、5 日間のインキュベーション後にトリパンブルーアッセイによって評価しました。この実験の対照グループは、何も含まずに 24 ウェルプレートの異なるウェルに置かれた細胞懸濁液でした。井戸の中の足場。結果は、足場が対照群と比較して細胞増殖を妨げる重大な細胞毒性効果を誘発しないことを実証した。実際、すべての足場は良好な生体適合性を示し、生存率は対照群と比べてあまり変わりませんでした。ただし、すべてのグループの平均生存率が同じであるように見えるため、結果は統計的に有意ではありませんでしたが、導電性足場の電気的性質は非導電性足場と比較して生存率を向上させているようでした（グループ間で P = 0.23、一方向）分散分析)。導電性足場は、以前の研究で観察された導電性足場の特性である電気的性質により、細胞間のコミュニケーションを改善し、相対的な生存率を向上させた可能性があります40、41、42。これは、対照と高濃度の PANI 足場の間に統計的有意性 (t 検定による) が存在する理由でもある可能性がありますが、低濃度の PANI 足場または純粋な PEGDA 足場では細胞間コミュニケーションが存在しないため統計的有意性が得られませんでした。これらの観察は、高導電性組織の再生に関しては、PEGDA-PANI 足場が従来の非導電性足場よりも優れた代替品となる可能性があることを示しています。

プリントされた足場上のマウス心臓前駆細胞 (mCPC) の生存率 (n = 6)。左側の代表的な顕微鏡写真は、(A) DAPI (青色の核)、(B) F アクチン (赤色)、および (C) それらの融合物で染色された mCPC を示しています。右上では、5 日間の培養後にトリパンブルーアッセイによって細胞生存率を評価しました。バーは、対照のパーセンテージに対する細胞の生存率を表します。データは、3回の実験の平均±SDで表されます。等分散の両側 t 検定を実行して、コントロールグループ (細胞懸濁液) と他のグループ (細胞懸濁液 + 足場) の間の統計的有意性 (*P < 0.05) を確認しましたが、グループ間の一元配置分散分析の結果は統計的に有意ではありませんでした。結果 (P = 0.23) は、棒グラフに示された値で観察できるように、平均生存率がすべてのグループで同じであることを示しています。

組織工学の聖杯は常に、工学的に意図された組織の特徴を正確に模倣することでした。これらの特徴には、組織の生体構造、弾性/剛性、生分解性、生体適合性が含まれますが、これらに限定されません。この取り組みにおける主要な役割は、ECM の構造と機能をエミュレートしながら、細胞の成長と分化をサポートするように設計されたポリマー構造である足場によって演じられます。血管、皮膚、膀胱、軟骨などの比較的単純な器官が設計されたとき、足場の設計は大幅に進歩しました43、44、45、46、47。むしろ、心筋は、その 3D 異方性、不可解な生体力学的特性、および複雑なマイクロ/ナノバイオ構造のため、工学的に作製するのが非常に困難です。

これまでのところ、心臓の足場は、細胞増殖の単なるサポートとして、生物学的に不活性な材料を使用して製造されてきました。その代わりに、心筋の天然の足場である心筋ECMは、線維芽細胞によって生成される足場材料であり、ゼリー状の物質（マトリックス）と異なる長さと硬さの繊維で構成されており、細胞の運命に対処することができます。休止状態の線維芽細胞は心筋内に動的に分布しているが、病理学的疾患は筋線維芽細胞の活性化を引き起こし、ECMの組成と蓄積、ひいては心筋機能を破壊する48。 ECMは、心臓細胞の運命を調節するために、生物学的信号（成長因子、サイトカイン、ホルモンなど）および物理的信号（機械構造因子、剛性、ナノ凹凸、マイクロ多孔性など）を伝達します。生物学的信号に加えて、細胞が機械的刺激を細胞内信号にどのように変換するかを解読することにこれまで特に注意が払われてきたが、電気信号を感知する細胞機構（電気感知）に焦点を当てた研究はわずかしかない。

いくつかの研究は、生体電気的手がかりと地形的手がかりの両方を備えた生体教育材料が、骨格筋などの高度に異方性の組織を再生するための有望なアプローチであることを証明しました。 49年には、エレクトロスピニングされたポリカプロラクトン足場中のナノファイバーの整列とPANI濃度が筋芽細胞の筋管形成を誘導することが判明し、電気的手がかりと地形的手がかりの相乗効果が確認された。しかし、導電性材料が細胞に指令を与える詳しいメカニズムはまだ理解されていない。他の研究 50、51、52、53、54 では導電性足場の有効性が実証されていますが、これまでのところその導電性の役割に関する決定的な証拠は報告されていません。実際、活動電位よりも弱い電気信号は、多電極アレイ技術を使用して細胞外で検出されました 55,56,57,58,59 が、おそらくその作用だけでは細胞の運命を決定するのに十分ではありません。導電性構造体の有益な効果は、ラット MI モデルの損傷部位に移植した場合にも観察されました 60、61、62、63。それにもかかわらず、これらの研究は主に、成熟心筋の特性を繰り返して梗塞後の傷跡によって生じた伝導ギャップを埋めることを目的としており、合理的なのは心筋収縮を司る電気インパルスのガイダンスを再作成することだけでした。革新的なアイデアは、収縮には関与していない可能性があるが、（他の物理的および生物学的信号とともに）細胞間のコミュニケーションに関連し、細胞の運命を決定する微小電流を識別して特徴付けるシステムを開発することかもしれません。これに関連して、我々は、未熟な心臓細胞の電気感知を研究するための導電性足場を開発するための予備的な技術研究を提案した。高解像度マイクロステレオリソグラフィープロセスの最適化により、導電性の 3D プリント PEGDA-PANI システムが得られました。異なる濃度の PANI により、電気活性と電気伝導度を調節することができ、電気信号と機械空間信号を相互に調整して未成熟細胞に刺激を与えることができます。これらの成果は、細胞の運命を決定し、最終的な表現型を維持するという観点から顕著です。この点において、実施された細胞生存率試験は、PEGDA-PANI材料が重篤な細胞毒性効果を誘発しないことを実証し、細胞の発生を支配する生物学的および物理的シグナルをより深く理解するための足場としての有効性を確認しました。

投影マイクロステレオリソグラフィーは、心臓組織の横紋の生体構造を模倣するのに有用なツールであることが証明されました。足場は、半導電性であっても、マウスの心臓前駆細胞とともに培養すると生物学的有効性を示しています。これは、未熟な心臓幹細胞の基準枠内で、半導電性足場が発生中の/未熟な細胞の細胞間コミュニケーションと同期を改善する可能性があることを示しています。

実際、心筋（0.16 S/m）と同程度の導電性足場の開発は、人工心臓組織を製造し、最終的には損傷した心臓の失われた電気機能を回復するために非常に望ましい。しかし、現在の技術を利用してそのような構造を開発することは依然として課題です。したがって、導電性の足場は、非導電性の足場と比較して、高導電性の生体組織を操作する場合に優れたプラットフォームを提供できると結論付けることができます。しかし、現在の導電性足場を半導体から良導体/高導体へと推し進めるには、生分解性で高い電気特性を示すことができる導電性ポリマーの新しい代替品を見つけなければなりません。

著者らは、この研究をサポートする関連データセットがこの記事内に記載されていることを宣言します。ただし、さまざまな発見を裏付ける生のデータセットは、対応する著者にリクエストすることができます。

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臨床科学およびトランスレーショナル医療学部、ローマ大学 "Tor Vergata"、Via Montpellier 1、00133、ローマ、イタリア

アルサラン・ウル・ハク、フランチェスカ・ペスコソリド、フェリシア・カロテヌート、パオロ・ディ・ナルド

再生医療部門間研究センター (CIMER)、ローマ大学 "Tor Vergata"、Via Montpellier 1、00133、ローマ、イタリア

アルサラン・ウル・ハク, フランチェスカ・ペスコソリド, フェリシア・カロテヌート, ファビオ・デ・マティス, エマヌエラ・タンブッリ & パオロ・ディ・ナルド

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受理日: 2023 年 2 月 10 日

公開日: 2023 年 2 月 17 日

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